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睾丸活检检查的详细过程       ★★★

睾丸活检检查的详细过程

作者:袁渭清 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2008/1/6 8:37:52

无精子症,顾名思义是指男性精液中不含有精子(虫),是男性不育症中的主要疾患。目前国内外医学界对此症的治疗虽没有特效方法,但也非不治之症。

那么究竟应该怎样对待无精子症呢?据笔者了解,国内有许多医疗单位特别是基层医疗单位,在精液常规检查中,一不做严格的取精时间规定,二不做离心沉淀法,一次查不到精子时,就认为是无精子症,而重度少精子症者的精液,在显微镜下,每个高倍视野,有时仅见到1-2个精子,若不采用离心沉淀法,就查不到精子。再者,精子自精囊进入附睾储存周期为5-7天,对于中度少精子症病人来说,如在性生活第二、三天取精液,就难以查到精子。为此,在临床上把一些重度少精子症误为无精子症的事情屡有发生,给患者带来不必要的精神负担。

一般来讲,无精子症可分为两种类型:一种是睾丸生精功能障碍致精子不能生成;另一种是睾丸虽然仍正常的产生精子,但由于输精管道的阻塞,致精子不能排出。因此遇到无精子症,首先应该查清为什么精液中没有精子,然后再决定如何治疗。

无精子症不是一个独立性疾病,它是有多种疾病引起的。一是要对可能产生无精子的原因进行详细的询问、调查和全面的体格检查,特别是生殖系统方面的检查;二是要作精液分析和精子数量、形态、活力的检查;三是有关内分泌方面的实验室检查,主要包括丘脑、垂体、肾上腺、性腺内分泌功能测定;四是睾丸活体组织学检查,它能了解是睾丸没有生精能力,还是有精子而不能输出体外;五是精路放射造影检查,了解排精功能有无障碍;六是遗传学方面的检查,以鉴别无精子是先天还是生下来以后发生的。

诚然,无精子症也不是都能治愈,为此,治疗无精子症首先要明确诊断,确定治疗价值,避免盲目无效治疗。所以,发现精液中无精子的应作进一步检查,以明确情况后再作相应和可能的治疗,不能一概的都认为无法治疗或者能治疗。最后应该指出的是真正的无精子症的治愈率在临床上是很低的。应审证求因,依据患者的具体病因及病情现状,给患者提供一个客观的病情诊疗指导建议。如:通过睾丸活检病理诊断为维支持细胞综合征的患者就要让其终止治疗行为,要么抱养子女,要么行非配偶间人工授精。若为梗阻性无精子症,下一步就要让其患者选择专业医生进行输精管造影检查以明确输精管道堵塞部位,如对由于腹股沟疝术后无精子患者,河南省商丘市民权县中医院不孕中心通过多年来临床经验积累,形成了一整套的完善的治疗程序,几呼能让所有类似患者无精子状况复以恢复。因此对于无精子症患者来讲,睾丸活检检查至关重要。下面我就对睾丸活检检查的相关知识作以简要的介绍。

常规切片

  • 取材
  • 袁渭清:睾丸活检检查是无精子症的一种常规检查方法,只需几秒钟在睾丸上做一个小手术就可全面了解生精功能。对指导下一步的治疗起着确定性的作用。睾丸活检是通过对睾丸曲细精管组织进行病理切片染色,通过显微镜对曲细精管生精功能的直接观察,来确定该患者的睾丸生精功能。就象一个农民种地播种以后,邻居家的地里面庄稼已经长多高了,而自己地里面一棵庄稼也未出芽,是地里面庄稼籽都沤完了,还是其它原因造成的种籽末发芽,到地里面把种籽扒出来一看也就清楚了。睾丸活检也是这个道理,有些无精子症患者连个睾丸活检也没做就这吃药那吃药,其结果只能是盲人骑瞎马,夜半临深池。不可能得到好的治疗效果。睾丸活检是睾丸活体组织检查的简称,是诊断男性无精子症的一种重要手段,过去往往使用穿刺法或切开法,抽取或切取少量睾丸组织,制成病理切片染色进行显微镜下观察:穿刺抽吸法常需多次穿刺抽吸,且有相当的假阳性和假阴性,这是因为针吸细胞学检查只能得到少数组织细胞,看不到组织的整体结构,对无精子症的诊断意义不大。切开法对人体损伤性大,创口较大且需要缝合拆线给病人增加了更多的痛苦。我通过长期临床工作实践,创立了一种快速睾丸活检新技术,该术是利用特殊器械,具有操作简便,创伤小,病人所受痛苦小,手术速度快(数秒钟内完成手术,是常规睾丸活检手术时间的二百分之一),术中无出血,无需缝合和拆线,术后恢复快,取得组织完整完全附合病检要求而深受无精子症患者欢迎!同时现在大多数医院的病理科大夫由于接触睾丸病理患者数量有限,经验积累不足,诊断报告为生精功能低下,或生精功能严重低下,生精细胞减少等不确定词语,使临床医生对病情诊断无所适从,而现有大部分临床医生又无睾丸病理阅片能力,为了对每一位患者负责到低,十几年来我对每一例患者的睾丸病理切片均亲自阅读,亲自医疗咨询,因为对于相当一部分无精子症患者来说这种诊断结果一出可能意味着该患者和医院交往的结束。
  • 固定
  • 固定是技术室工作的第一步,也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓固定,就是组织离体后,用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败,防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用,使细胞内的各和成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质,以保持原有的结构与生活时相仿。另外,组织固定后,均呈一定的硬化状态,增加组织韧性,而且不易变形,有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定,固定液的量应为组织的4倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。
      甲醛 (HCHO)是一种无色易溶的刺激性气体。市售甲醛水溶液实际浓度为40%,易挥发,日久会自行分解,产生白色沉淀(副醛:多聚甲醛或三聚甲醛),并有甲酸产生,使溶液呈酸性,影响细胞核的染色。我们用作固定的为10%甲醛水溶液(实际含甲醛4%,又称福尔马林液)。
    优点:
    1 渗透能力强,固定均匀。
    2
     收缩小。

    3 能保存脂肪和类脂体(冰冻切片法)。
    4 能增加组织韧性。
    5 有利于嗜银染色。
    6 对抗原保存良好。
    缺点:
    1 溶解糖类和尿酸结晶。
    2 经甲醛固定的陈旧组织较易产生色素沉淀。(去除方法:用Schridde法:浓氨水1毫升加入75%酒精200毫升内,切片脱蜡后处理30分钟,如还有再延长,流水冲洗)。
    酒精 CH3CH2OH,是一种还原剂,不能与铬酸、重铬酸钾等氧化剂配成固定液。
    优点:
    1 酒精有固定,硬化和脱水的作用。
    2 保存糖原可用100%酒精固定。
    缺点:
    1 渗透力较弱。
    2 容易造成表面发硬,较难渗透到组织深部。
    3 核蛋白沉淀后仍能溶于水,导致核的着色不良。
    4 可溶解血红蛋白和损害多种色素。

苦味酸 2,4,6-三硝基苯酚,黄色晶体,易燃易爆,应制成饱和溶液贮藏。
能沉淀蛋白,也有软化组织的作用,还具有一定的脱钙作用,固定后的组织必须流水冲洗4小时以上才能脱水。一般与其它液体配合使用,如Bouin液:苦味酸85 ml,甲醛10 ml,冰醋酸5 ml
重铬酸钾 K2Cr2O7 ,桔红色结晶,5%水溶液作固定用。可使蛋白质变为不溶性,不能沉淀蛋白质。但在溶液中加入醋酸后,也能使蛋白质沉淀。用未酸化的重铬酸钾固定,可保持与生活状态相仿,对线粒体、高尔基氏体的固定很好,而且其穿透力极强,组织收缩亦小。缺点是溶解染色质。固定后的组织必须流水冲洗12小时以上。
醋酸 CH3COOH 5%水溶液作固定用。不能沉淀白蛋白,但能沉淀核蛋白。渗透性强,固定快,能使组织膨胀。常与其它液体配合使用。

观点:
1
、笔者认为,10%甲醛液由于受到甲醛的质量、使用时的挥发和取材时带入的水分影响,浓度被降低致组织固定不足,而高浓度的甲醛,降低了对组织的穿透性,形成周围固定好而中央固定不到的现象。通过实践,本人认为以1215%的甲醛最佳。大标本(2cm厚)一般需要612个小时,小标本一般需要36个小时;当室温低18时,可在37以下的温箱内加温46个小时。由于HE染色最佳着色PH3.54.5, 中性甲醛对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。骨髓、结缔组织固定以Bouin液为佳,经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液;少数单位还可建立组织冷冻库,以便适应各种特殊的处理要求。

2
、经Bouin液固定的骨组织,如果脱钙不佳,还可再用10%硝酸脱钙,效果也不错。
3
、有学者认为:“发灰”的主要原因是经中性甲醛固定后组织PH值呈弱碱性,不利于苏木素染液的结合。如能在染苏木素前调整组织切片的HP至酸性可改善染色效果。在脱蜡水化后把切片浸入3%的乙酸溶液内(PH3.0)处理5分钟,流水冲洗5分钟,常规苏木素染色。用酸处理后可明显改善染色“发灰”现象,提高红蓝反差。但也有学者认为用酸处理后效果不明显。
4
、甲醛可用作溶剂、防腐剂、还原剂。现代科学研究表明,甲醛对人体健康有负面影响。当室内含量为0.1毫克/立方米时就有异味和不适感;0.5毫克/立方米时可刺激眼睛引起流泪;0.6毫克/立方米时引起咽喉不适或疼痛;浓度再高可引起恶心、呕吐、咳嗽、胸闷、气喘甚至肺气肿;当空气中达到230毫克/立方米时可当即导致死亡。长期接触低剂量甲醛可以引起慢性呼吸道疾病、女性月经紊乱、妊娠综合症,引起新生儿体质降低、染色体异常,甚至引起鼻咽癌。高浓度的甲醛对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害。它还可刺激眼结膜、呼吸道黏膜而产生流泪、流涕,引起结膜炎、咽喉炎、哮喘、支气管炎和变态反应性疾病。甲醛还有致畸、致癌作用。据流行病学调查,长期接触甲醛的人,可引起鼻腔、口腔、鼻咽、咽喉、皮肤和消化道的癌症。保持室内空气的流通和良好的换气,是病理科必不可少的条件。笔者认为,修建取材台时,抽气口做在台子下方,更利于甲醛气体的排出。
混合固定液
1
 Altmann液:用于固定线粒体,脂肪。固定时间约12-24h
固定液配方:5%重铬酸钾水溶液10ml2%锇酸水溶液10ml
2
B-5固定液(醋酸钠-升汞-甲醛固定液):多用于固定淋巴组织。在染色前,应进行脱汞处理。
固定液配方:无水醋酸钠1.25g,升汞6g,甲醛10ml(用时加入),蒸镀馏水90ml
3
B-4固定液:无水醋酸钠1.25g,升汞6g,蒸镀馏水100ml。在染色前,应进行脱汞处理。
4
Bouin液:是外科活检标本特别是骨髓、睾丸等组织固定的良好固定液。适用于结缔组织染色,尤其是三色染色时更为理想,组织细胞结构完整,细胞核着色鲜明,但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好,尤其适用于含脂肪的淋巴结,乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸,pH3-3.5,对抗原有一定损害,使组织收缩,不适宜于标本的长期保存。固定时间12-24h。固定后组织被染成黄色,需要70%-80%酒精洗涤或流水冲洗。
固定液配方:饱和苦味酸水溶液:甲醛水溶液:冰醋酸=75255
5
 Carnoy液:固定胞浆和细胞核,对于染色体固定佳,显示DNARNA效果好。此液固定速度快,3mm厚的组织块1h固定左右,大块材料最好不要超过4h
固定液配方:冰醋酸10ml,氯仿30ml,无水酒精60ml
6
 Champy  主要用于固定线粒体和高尔基复合体。该固定液穿透能力差,组织块应小。固定时间6-24h,固定后流水冲洗过液。
固定液配方:3%重铬酸钾70ml1%铬酸70ml2%锇酸40ml
7
 Helly  该液也称为Zenker福尔马林液。该固定液对细胞质固定较好,对某些细胞质内特殊颗粒、胰岛和垂体前叶各种细胞的显示及心肌闰盘保存有良好的效果。
固定液配方:重铬酸钾2.5g,升汞5g,蒸馏水100ml,甲醛5ml
在染色前,应进行脱汞处理。
8
 Kanovsky液:适用于免疫电镜标本的前固定,对细胞抗原性和细胞微细结构的保存较戊二醛好。固定时一般先灌注,而后再浸泡固定10-30min,用缓冲液漂洗后,用蔗糖液浸泡后恒温冷冻切片。
固定液配方:25%戊二醛10ml40%甲醛5ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液49ml,无水氯化钙50mg,蒸馏水33.5ml,蒸馏水最后加入,pH7.3
9
 Kolmer液:用于眼球和神经组织的固定。固定时间24h左右。
固定液配方:5%重铬酸钾水溶液4份,10%甲醛4份,冰醋酸1份,三氯醋酸水溶液1份,10%醋酸钠水溶液1份。
10
 Metchcarn液:适用于某些癌基因蛋白产物和一些抗原的固定,固定时间:室温4-24h
固定液配方:甲醇60ml,氯仿10ml.醋酸10ml
11
Romeis液:可作为一般固定液应用,也可用于其他固定液固定后的再固定。有利于Heidehain铁苏木精染色,有后媒染作用。
固定液配方:升汞饱和水溶液50ml5%三氯醋酸水溶液40ml,甲醛10ml(临用时加入)。固定时间12-24h ,固定后入95%酒精脱水。
12
Rossman液:对糖原固定较好。固定12-24h后,固定后用95%酒精洗。纯酒精脱水。
固定液配方:无水乙醇苦味酸饱和液90ml,甲醛10ml
13
Verhoeff  用于固定眼球,固定48h后,即可脱水。
固定液配方:甲醛水溶液10ml95%酒精48ml,蒸馏水36ml,苦味酸1g
14
Zenker液:为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织,使细胞核和细胞质染色较清晰,常用于三色染色。对免疫球蛋白染色最好、病毒包涵体(如Negri小体)的固定效果较好。进行磷钨酸-苏木精染色的组织也应该使用该固定液。但对于含血量较多的标本不合适。固定时间12-36h,加热可加快固定作用。
固定液配方:储存液由重铬酸钾2.5g,升汞5g,蒸馏水100ml 组成,用时加入冰醋酸5ml。配制该液体时,可将重铬酸钾和升汞一起加入蒸馏水中,加温40-50溶解,冷却过滤后存于棕色瓶内。同时取此液95ml,加冰醋酸5ml即可。此固定液不能用金属容器盛放,组织固定后,也不能用金属镊夹取。如果此液中的冰醋酸用甲醛代替即为Helly液。在Zenker储存液中加入10ml甲醛水溶液,为Maximow液。
固定后流水冲洗12h去除重铬酸钾,或用亚硫酸钠溶液冲洗,也可用1%的氨水溶液洗涤。在70%酒精脱水时加入碘(配成0.5%碘酒)脱汞。
15
4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3):该固定液适用于免疫组织化学方法。动物先用此液进行灌注固定,取材后,再用该液浸泡固定2-24h
固定液配方:40g多聚甲醛,溶于1000ml0.1mol/LPB液,不容易溶解,放于密封瓶中,60温箱过夜即可溶解,也可以加温至60,搅拌溶解。
16
4%多聚甲醛-磷酸二钠/氢氧化钠液:该固定液适用于光镜和电镜免疫组织化学方法。用于免疫电镜标本时,应加入新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为0.5-1%。此固定液性质温和,可长期保存组织。
固定液配方:甲液-多聚甲醛40g,蒸馏水400ml;乙液-NaH2PO42H2O16.88g,蒸馏水300ml;丙液-NaOH3.86g,蒸馏水200ml。先将甲液中多聚甲完全溶解,乙液倒入丙液混合后倒入甲液,用1mol/LNaOH1mol/L HCLpH调至7.2-7.4。补充蒸馏水至1000ml,充分混合后,4保存。
17
、中性缓冲甲醛液:对大多数抗原保存较好,是免疫组织化学最常用的固定液,组织穿透性好,组织收缩小。固定时间以24h以内为宜。
固定液配方140%甲醛10ml0.01mol/L pH7.4PBS90ml
固定液配方240%甲醛120ml,蒸馏水880ml,磷酸二氢钠(NaH2PO4H2O4g,磷酸氢二钠(Na2HPO413g

  • 水洗
  • 固定后水洗(1020分钟),通常被很多人所忽视,而水洗不彻底,容易造成脱片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织,更不应当忽视。甲醛不利于组织块内抗原的保存。
    观点:
      固定后水洗还是有必要的。AF液固定效果也不错,但由于固定后不必水洗直接脱水,故不提倡。组织处理还是应从长远的利益出发。
  • 脱水和透明
  • 所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入,这一过程称为脱水。脱水是否彻底,直接关系到组织是否能充分透明,而脱水过度(原因是组织在纯酒精内时间过久,发生组织质地发生变化)容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温(温度超过36)、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关,而忽视了与低浓度的酒精关系,其实低浓度的酒精具有强大的穿透力,比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水,组织如果在低浓度酒精里充分脱水,在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份,因此,仅需短时间就可完成,如果这时不缩短纯酒精的时间,便会引起组织发脆;如果脱水时加温,使用丙酮,还可引起组织收缩,并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内,必须经过一种既能与脱水剂混合,又能与石蜡相溶的媒介物质,这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆,这个观点很片面,在常温下,如果不是时间过长(超过24小时以上)二甲苯并不会引起组织过份发脆,相反会使某些组织结构比较质韧的组织:如子宫肌瘤等相当好切),但是当二甲苯温度超过36-40以后,极易引起组织发脆。所以本人认为,大小标本最好分开脱水,一般情况下,大标本脱水时间(室温18)以80%酒精2小时、95%酒精(2道)各1个半小时至2小时、纯酒精(3道)各1个半小时至2小时,二甲苯(2道)各30-60分钟为宜;小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短,与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现,室温在1215℃时,可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时,组织容易脱水,可适当缩短脱水时间;而室温低于该温度范围时,应适当延长脱水时间(如能保证在一个恒定的温度下最佳)。更换试剂,应以量为基础,定量更换,不能等到切片不好时再去更换。否则,至少会有23批组织切片不好。根据我科经验,如试剂用量为500ml,每500个蜡块更换一次为宜。
  • 浸蜡
  • 组织透明后,在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其他浸透剂(如火棉胶、明胶等)渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高(超过60),在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多,都会导致组织发硬,还会使组织内的抗原受到破坏;所以作者主张浸蜡用的石蜡熔点在56(三道),第一道:石蜡30分钟;第二道:石蜡90分钟;第三道:石蜡,90分钟。浸蜡温度控制在5658℃左右。(第一道也可用硬脂酸石蜡13浸蜡,不仅可软化组织,特别适用于比较韧、硬的组织,而且由于硬脂酸是弱酸性的,对细胞核有媒染作用,核浆比鲜明。但容易脱片;同时对疏松组织容易散片)。有条件的可以每天打开第一道石蜡的盖子,让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤,以防附在组织上,造成切片刀刀口受损,或切片破碎和划痕增多。
  • 包埋
  • 用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整,二是方位。要求在包埋时,应采用镊子轻压组织块拱起部份,使之平贴于底部,通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织,应尽量放在一起,并保证在一个平面上。修去两边的余蜡(所谓的两边,指切片时与切片刀垂直的两侧)。包埋时还应注意有无缝线,纸絮,如有一定要去除。胃黏膜活检标本,不能按一般的规律取最大包埋面,应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤,留有杂质的石蜡,容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在5658℃之间选择,融蜡的温度在6062℃左右,不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块,到了夏天,会粘在一起,不利于资料的保存,而且即使在冬天,用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
  • 磨刀
  • 要想切好一张切片,首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术,刀磨的好坏,直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同,但都要求用力均匀,使刀口和磨刀石全面接触,两手的用力点应在刀口上,而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次,每次仅需1015分钟,过长时间的磨刀,容易把已经磨出的锋刃磨掉,检查切片刀是否锋利,用手试摸刀口的方法并不十分科学,不仅不能证明切片刀是否真正锋利,而且容易损害刀口,最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后,应将磨刀石用盖子盖好,以防灰尘掉在磨刀石上,用有灰的磨刀石磨刀,会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机,磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错,但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握,故效果并不理想。根据我们的经验,真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片,必须及时更换刀口。一个刀口切小标本不应超过2025只蜡块,切大标本不应超过1015只蜡块。
  • 切片
  • 切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在50100微米左右,质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些,粗切致组织全部暴露后,才进行细切。细切至组织块表面均匀一致,无白点后,再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和,摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均,机器磨损;过慢会使切片增厚。切片厚度一般为35微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致,切片的不完整,常会将重要病变遗漏,导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时,应注意组织包埋的方向,组织的层次,纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行,较难切的部分应放在上面,如皮肤的表皮,肿块的包膜,胃肠道的浆膜等,这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀,避免用力过重。对脱钙组织、骨髓,以及已知的钙化组织,应选用固定的刀口,以减少某他部位出现缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口,因为每切到一根笔丝,就会增加一个缺口。切片厚度一般为46微米,有人认为:只要切片机刻度标着几个微米,切出来的片子就是几个微米。其实不然,当切片刀不锋利,或切片时速度不匀,或切的较慢时,切的片子都会变厚,只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下,才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法:(1)组织发脆:一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高,并与组织本身质地也有关,在切片时,边切边用嘴向蜡片吹气,可能会好些。(2)切片卷起,可能是刀不锋利,或刀锋在另一面,或刀角度过大,切片太厚等等。(3)蜡片弯曲:可能是刀锋不均,切片刀未磨直,切片刀与蜡块不平行。(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高,并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均:可能是刀、刀座及蜡块未夹紧,组织太硬,或切片机主轴太向前,或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕:可能是刀有缺口,石蜡内有杂质,组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不连片,切不下片,切片很厚,或者切片后蜡块发白,内陷:组织脱水不佳。补救办法:可先将蜡块溶解,取出组织,放入加热水浴的丙酮内(80),3060分钟,再进行透明浸蜡包埋切片,也许会好一点。平时切片中碰到一些处理不好的标本(组织脱水或者是浸蜡不充分)和难切的蜡块时,在切片时很容易卷起或切出是碎片,出现这样的情况就很难捞片。在这里给大家介绍一种方法可以克服这个问题。把载玻片盒子里的隔离纸撕成和蜡块大小的面积(普通的薄纸也可以),粘点水贴在已经修好片的蜡块上,再切,纸片上就已经粘上了你要切的片子了,直接拿出纸片反向放入漂片机内漂平即可,在切片是散片的情况下应注意严格控制水温,不宜太高。我刚进病理科时我的老师整天就用此法切片。但这也是我一直反对的做法,原因不在于此法的本身,而在于处理问题的一个思路,有的技术员因有了此法,再不考虑如何将脱水不好的组织处理好,反正有办法应付,这样做出来的片子肯定没有脱水好的组织质量好。所以我是要求将重点放在组织处理上。只要组织全部处理好了,这方法也就没用了。
  • 展片与捞片
  • 展片水温应在4245之间,这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高,会引起组织细胞散开,水温过低,切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯,也会造成石蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子,一碰到热水,片子上的皱摺就无法再展开,这有二个方法可以解决:第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气,这样的片子就会非常平整,放到热水里就会自然展开,比较方便快捷,但这样的片子会略微厚一点;第二、在切完片子后,先把切片放在30%酒精水溶液中,让酒精的张力自动把皱摺展开,然后再将切片移到热水,这样的片子会较薄;如酒精浓度过高,容易引起切片破碎,出现裂隙,像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开,故不能用此法。最后捞片时玻片要干净,要选择那些完整、无皱摺的切片,粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。


  • 烤片和脱蜡
  • 烤片,一般在60℃的温箱内烤片0.51小时左右,温度过高,会引起切片细胞收缩;时间太短(少于20分钟),容易造成脱片。

  脱蜡也相当重要,如果脱蜡不干净,切片不易着色或着色不匀,所以,脱蜡用的二甲苯要经常更换,一般用3道二甲苯,每500ml液体,处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18时,必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡,或将二甲苯放入温箱内预热(37左右)脱蜡,最高不得超过60。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯,至水。

  • 染色
  • 一、染色的作用
    染色的作用是为了提高标本各部分在光学显微镜下的分辨率。
    未经染色的组织切片和细胞涂片不能直接在光学显微镜下观察。即使是显微镜有足够的分辨率和合适的放大倍数,还必须要求标本各部分结构对光的折射率有较显著的差别,方能加以辨认。


二、生物染料
染料从来源上可分为天然染料(如苏木精、卡红、巴西木精)和人工合成染料;从化学组成上可分为无机染料和有机染料。我们常用的染料主要是人工合成的煤焦油染料,它主要是含主香碳环和杂环的有机化合物。这些有机化合物必须自身具有颜色,同时与被染物质分子间有一定的亲和力方能称为染料。我们知道,染料的颜色和与被染物分子间的亲和力是由染料的分子结构决定的。在染料分子中有使其产生颜色的发色团和使染料颜色加深的并与被染物质间产生亲和力的助色团。
(一)发色团
使有机分子产生颜色的含有不饱和键的基团称为发色团也称生色团。将发色团引入分子之后可使有机化合物选择性吸收光谱向长波长移动,即从肉眼不可见的紫外光区移向可见光区,从而使分子显色。有机分子中引入发色团有可能使有机化合物显色,但在有机分子中仅仅有发色团并不一定就显示颜色,还要看发色团被引入有机分子后,是否使有机分子形成较大的共轭体系,共轭程度越大颜色越深。有颜色的有机分子必需引入助色团,才能与被染物分子产生亲和力,使被染物着色,因此把有发色团又有助色团的有机化合物称为染料。
(二)助色团
能够使染料分子颜色加深,极性加大,并与被染物质分子间形成亲和力的基团称为助色团。使染料分子与被染物质分子间产生亲和力是助色团最主要的作用。助色团使染料分子色度加深、染料分子极性增强,易离子化。
助色团多为极性基因,有的还具有酸碱性,如—OH与苯环相连有弱酸性,—NH2及其取代物具有碱性,—SO3H具有强酸性,—COOH具有弱酸性,这些基因引入有机分子之后不仅增强其极性而且与碱或酸成盐,易溶于水并电离成正负离子,促进染料与被染物分子间的结合。


三、染料的分类
1、天然染料
2、合成染料(又称煤焦油染料)
合成染料都是从煤焦油中提取苯的衍生物。它还可以按其分子中所含的发色团现分为九大类(或十大类)。
1)亚硝基染料类
发色团为亚硝基(—NO),如萘酚绿—B
2)硝基染料类

发色团为硝基(—NO2),如苦味酸,萘酚黄—S,马汀黄。
3)偶氮染料
发色团为偶氮基(—N=N—)。这一类染色剂很多。常用的有偶氮红,刚果红,偶氮焰红,丽春红,俾士麦棕,橙黄-G,苏丹I-Ⅳ,苏丹黑-B,油红-O等。
4)重氮盐类
5)醌亚胺染料
这类染料分子中含有两个发色团,一个是亚胺基及一个醌基常用的有:中性红,美蓝,,尼罗蓝、天青石蓝甲苯胺蓝,硫堇、亚甲绿、萘酚蓝、沙黄、亚甲紫、天青、焦油紫等。
6)苯甲烷类染料
发色团为醌基,分子结构中一个碳原子上连有两个苯基和一个醌基。
常用的有:碱性品红,酸性品红,苯胺兰,二甲苯蓝,依思明蓝,亮绿,碘绿,黄色浅绿—SF,孔雀绿,甲基绿,结晶紫、霍夫曼紫、乙基紫,尤胆紫(无水结晶)、甲基紫等,如:孔雀绿的结构。
7) 叮类染料
发色团为醌基。
8)蒽醌染料
发色团为醌基。
9)噻唑类染料
发色团为胺基,偶氮基等。
10)喹啉类染料
发色团为醌型结构喹啉环。常用的喹啉类染料为花青素(喹啉蓝)。
3、无机化合物
除了天然染色剂和合成染色剂之外,在生物染色中还使用一些无机化合物,如氯化金、硝酸银、碘、高锰酸钾等。
(二)根据染料的化学反应分类
因为助色团有酸性助色团和碱性助色团之分,故染料也就相应地有酸性染料和碱性染料之别。
1、酸性染料
酸性染料不是指其水溶液一定显酸性。而是指含有酸性助色团与碱作用成盐,其水溶液电离出的有色离子为阴离子染料为酸性染料。酸性染料是一类色酸盐,含有酸性助色团,常与碱作用生成钠盐、钾盐、钙盐或铵盐,一般溶于水和乙醇。多作为胞浆染色剂。常用的有伊红、酸性品红、苦味酸、刚果红、甲基蓝、水溶性苯胺兰、坚牢绿-FC和橙黄-G等。
2、碱性染料
是一类色碱。含有碱协助色团,其水溶液不一定显碱性,而是与酸能成盐,如与硫酸、盐酸成盐,电离后有色离子为阳离子,这类染料一般能溶于水和乙醇。多作为胞核染色剂。常用的有苏木红(天然染料)、美蓝、中性红、甲基绿、孔雀绿、甲苯胺蓝、尼罗蓝、沙黄等。


四、染色的物理作用和化学作用
染料和被染物结合而着色的过程是相当复杂的。如染料与被染物之间的相互作用,染料与助染剂之间,染料与溶剂之间,被染物与溶剂之间,都存在一定的相互作用和影响。在染色过程中染料与被染物之间既存在物理作用,又存在化学作用,是二者合作用的结果。
(一)物理作用
染色的物理作用包括毛细现象,吸附作用和吸收作用。
1、毛细现象
毛细现象又叫毛细管作用。含有细微缝隙的物体与液体相接触时,液体靠表面张力沿细微缝隙上升或扩散的现象叫毛细现象。缝隙越细毛细现象越显著。内径小到足够引起毛细现象的管子叫毛细管。组织有许多的微孔,就可借助毛细管作用与染料接触,这是纯粹的物理作用,相当于混合,结合得不牢,不能称为染色,但染色过程它是第一步。
2、吸附作用
吸附是指物质在相界面上浓度自动发生变化的过程,是一种物质从它的周围把另一种物质的分子、原子、离子集中在界面上的过程叫吸附作用。具有吸附作用的物质叫吸附剂,被吸附的物质叫吸附质或吸附物。吸附作用又分物理吸附和化学吸附。
物理吸附是由于范德华力引起的,作用力弱、吸附为多分子层、无选择性。吸附热小,吸附速度快。化学吸附是由于形成化学键的结果。作用力强,是单分子层吸附、有选择性、吸附热大、吸附速度慢。在低温下进行的吸附一般都是物理吸附。化学吸附常在较高的温度下进行。
3、吸收作用
吸附质如果进入了吸附剂的内部并均匀地分布在其中,这种现象又称为吸收。
4、分子间的作用力
分子间的作用力是由范德华(Van der walls)第一个提出的,所以把这种力叫范德华力。
(二)化学作用
组织和细胞内化学物质的分子内含有酸性、碱性和两性基团。在一定条件下,被染物质的分子以这些基团与染料分子的助色团发生化学结合而染色。结合方式:离子键,共价键和氢键。

五、细胞的染色
(一)细胞核的染色
细胞核的主要化学成分是核酸和蛋白质。
蛋白质分子中的氨基酸残基含有酸性基团或碱性基团,它可以与染料分子以离子键,氢键或配价键结合。蛋白质的两性电离受环境的pH值影响。核酸包括DNARNA。核酸是由单核苷酸连接成的大分子。在DNA双螺旋结构中,两条核酸链上的磷酸基向外,并电离为负离子使DNA双螺旋的外侧带负电荷。因此容易和带正电荷的碱性染料以及媒染染料以离子键或氢键相结合。染色体的主要成分为呈酸性的DNA、和RNA,在染色体环境(pH7.5-7.8),呈酸式电离,带负电,易被电离后带正电荷的碱性染料染色。核质的主要成分为碱性蛋白质,电离后带正电荷,易被负电荷的酸性染料染色。而核仁具有酸碱两性的性质。
(二)胞浆染色
胞浆的主要化学成分是蛋白质,其次是RNA和脂蛋白质等,多为两性化合物。胞浆的等电点大约在pH4.7-5.0。胞浆的染色与pH值密切相关。当pH值在3.6-4.7之间,恰好胞核带负电荷为碱性染料染色,胞浆带正电荷为酸性染料染色,使胞核和胞浆区分开来。
(三)胞膜的染色
细胞膜的主要成分为类脂和蛋白质,形成流动镶嵌脂质双层结构。膜的外表面分布有糖脂、磷脂和蛋白质,带负电荷,易被碱性染料染色。


六、媒染染料的染色
(一)媒染染料
有些染料直接对组织染色时,由于染料与组织间的作用力很弱,有时甚至无作用,因此组织着色很浅,甚至不着色。我们必须将这类染料先与媒染剂(如金属离子)结合,生成色淀再对组织进行染色。凡是能与媒染剂(如金属离子)结合生成色淀的染料称为媒染染料。
常见的媒染染料多半是天然染料,如苏木精,卡红等。
人工合成的煤焦油染料一般不需媒染剂,但有时媒染剂可加强其染色效果,提高染色的坚牢度。
(二)媒染剂
凡能和组织及染料结合,生成色淀,并促进染色的金属离子盐类或金属原子的含氧酸等称为媒染剂。媒染剂既能和染料结合,又能和组织结合,在组织与染料之间起到一个媒介的作用。
常用的媒染剂多为过渡金属元素,一至三价的可溶性盐类或氢氧化物,如铝盐、铁盐、明矾及金属含氧酸等。
(三)促染剂
促染剂是指只增强染料的染色能力,但不参与染色反应的一类物质。如美蓝染液中的氢氧化钾,伊红染液中的冰醋酸、洋红染液中的硼砂、硫堇染液中的石炭酸,金属浸润法中常用的巴比妥及佛罗那等。促染剂的作用是增强染料的染色能力,它与媒染剂的区别在于它不参加染色反应。


七、苏木精-伊红染色方法
苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,简称HE染色方法,是细胞与组织学最广泛的染色方法。
一、HE染色的基本原理
(一)细胞核染色的原理
细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸(DNA),DNA的双螺旋结构中,两边链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精硷性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。
(二)细胞浆染色的原理
细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染我以,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。
(三)、二甲苯的作用
烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去,染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同,以便显微镜观察。
(四)、酒精的作用
酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯。
伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份。
(五)、水洗的作用
在脱蜡经酒精处理之后,水洗切片,是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去,使细胞核染色均匀。
染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。
分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料,中止分化作用。
在伊红染色之后也可以水洗,是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。
(六)分化和蓝化作用
1
、分化作用
苏木精染色之后,先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用分化液1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料,这个过程称为染色的分化作用。
2
、蓝化作用
分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,在碱性条件下则处于蓝色离子状态,而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化再用温水或弱碱性水使染上苏木精的细胞核变蓝色,称蓝化作用,以自来水浸洗或温水变蓝为佳。

  • 脱水和封片
  • 切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精,80%酒精1道,95%酒精2道,纯酒精2道,(正丁醇1道),二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水,但也容易使伊红退色,故脱水时间可短一点,每道35分钟,纯酒精每道10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性,可在二甲苯前面增加一道正丁醇;石碳酸-二甲苯液也有此效,但用石碳酸时如不洗净,可引起切片退色,不利于切片久存,故不作推荐。切片经二甲苯透明后,用中性树胶封固。为增加切片的透明度,防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点。
      所以我们质控规定切片必须湿封,不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季节,封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片;在天气较潮湿的日子里,不宜一次将多张切片取出待封,以免切片“还潮”,形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体,处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀,封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖,也不能有气泡。最后,粘贴标签,标签必须贴于玻片左侧,编号书写清楚,最好能打印。
  • 常规组织脱水、透明、浸蜡时间表(仅作参考)
  • 1 固定(3546小时
    2 水洗 30分钟
    3 85%酒精(35 2 小时
    4 95%酒精(35 1.5 小时
    5 95%酒精(35 2 小时
    6 100%酒精(351.5  小时
    7 100%酒精(35 1.5小时
    8 二甲苯透明 30分钟
    9 二甲苯透明 30分钟
    10 浸蜡(6030分钟
    11 浸蜡(601.5 小时
    12 浸蜡 (602 小时
  • 塑料包埋制片技术
  • 用塑料包埋切片能制备高质量的组织切片,与石蜡切片相比,具有细胞收缩小、结构清晰、分辨力高等优点,但由于操作复杂,费时又费刀,故除骨髓等有特殊要求的切片外,很少会有人使用此方法。
    1
    、 取材:要求修成2 mm厚的薄片。
    2
    、 固定:10%中性福马林或Bouins液。根据标本大小固定时间为:24小时不等。
    3
    、 脱水:组织块脱水用梯度酒精(80%95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%Ⅰ、100%Ⅱ)。较大的组织(10x15x2mm)每步3060分钟;中等组织(5x5x2mm),每步1520分钟;小组织(3x3x2mm),可不脱水,直接入浸透液。骨髓组织可用5%硝酸脱钙,或不脱钙直接脱水、包埋。脱水时间比同样大小的组织长23倍。
    4
    、 浸透:取甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯(HEMA )95ml,聚乙二醇(PEG-4008 ml,过氧化苯甲酰0.7g,混匀溶解后置于棕色瓶,4备用。浸透时间为2448小时,其间更换一次浸透液。
    5
    、 包埋:A液:即浸透液。B液: PEG-400 20N ml N-N二甲基苯胺1 ml混合,摇匀溶解后置于棕色瓶,4备用。包埋剂必须在使用前配制,按AB二液以1003的比例混合,稍加搅拌便可使用。经浸透的组织块置于塑料模具内,注入包埋剂,放置3060分钟(室温高于18可放置于冰箱中),待包埋剂完全渗入组织后,在包埋模具上加盖,在室温中放置,使其聚合,成型后便可切片。
    6
    、 切片:先用钢锉修整聚合块,四周尽量修至靠近组织,表面修至组织完全暴露,用常规石蜡切片机切片。切片厚度可切12цm
    7
    、 展片与烤片:用4042℃水温展片,捞至干净载玻片,6080℃的温箱烤片1小时左右。
    8
    、 染色与封片:塑料切片染色前不必脱去包埋剂,直接染色。苏木素3分钟,水洗,盐酸酒精分化12秒钟,水洗,温水蓝化,伊红2-5秒钟,水洗,吹干后中性树胶封固。
  • 常用HE试剂配制
  • 一、 苏木素
    (1) Harris苏木素(退行性染色):
     
    配方:    

 苏木素    1 g      无水乙醇    10 ml
 
蒸馏水 200 ml      钾明矾       20 g              
 HgO     0.5 g

先将苏木素溶于无水乙醇中,备用。把明矾放入蒸馏水,加热溶解,再加入备用的苏木素,煮沸 2 分钟,先加入少量的氧化汞,防止氧化过程中苏木素外溢,玻棒搅拌,然后,边搅拌边加入氧化汞。加完后,立即移至冰水中,加速其冷却,静置一夜后,过滤。用前以 5% 的比例加入冰醋酸。如配好后时间较长,冰醋酸的量可适当多加一点。冰醋酸的量,可直接影响苏木素的着色能力和清晰度。加少了,会造成核浆共染,背景不干净;加多了,核着色能力下降。此液可放置3月至半年左右,视气温而定。使用期要看染色的切片量来定:以每天100张片的量,可使用半个月左右。

2Gill改良苏木素液(进行性染色):
     苏木精       2  g            无水酒精     250 ml
    
硫酸铝     17.6 g            蒸馏水       750 ml
    
碘酸钠      0.2 g            冰醋酸       20  ml

    先将苏木精溶于无水酒精,硫酸铝溶于蒸馏水,然后两液混合后加入碘酸钠,最后加入冰醋酸。此液为半氧化进行性苏木素液,染色不需要分化,不会产生沉淀,氧化膜少。

二、伊红
1)伊红(水溶性)
   
配方:
   
伊红 (水溶性)         2 .5 -5g   
   
蒸馏水                       500 ml
   
将水溶性伊红溶于蒸馏水中,然后加浓盐酸10毫升,充分搅拌,静置过夜后过滤。过滤后的沉淀用蒸馏水冲洗二次,再过滤;将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥,加95%酒精1000毫升,配成饱和液。使用前再用95%的酒精 1:12倍稀释,加入12%冰醋酸。
   
此方法具有染色时间快,颜色鲜艳,不容易褪色,使用寿命长等特点。
2 伊红(醇溶性)
     
配方:
   
伊红 (醇溶性)      2 .5-5g
    95%
酒精                  1000 ml
  
加冰醋酸至半透明状,冰醋酸过多,可导致染浆时细胞核酸化。
三、盐酸酒精分化液:
  浓盐酸        0.51 ml
  75%酒精         99 ml
四、清洗液:
   30%
盐酸或者用5%苯酚水溶液浸泡24小时,取出后充分水洗。此法可用于盖玻片或载玻片处理。


  • 脱钙液
  • (一)酸性溶液脱钙法
    1
    .硝酸-间苯三酚液:
    浓硝酸10ml,间苯三酚1g,通风橱内混合。混合时会产生浓的棕黄色双硫磷烟雾。然后加10%硝酸 100ml
    骨组织块5mm厚脱钙时间12-24小时。
    优点:该液脱钙速度非常快,大概是所有脱钙液中速度最快的一种脱钙液。
    缺点:
    1)细胞核染色很差。
    2)如果脱钙时间太长对组织有较大的损害。
    3)要用5%硫酸钠液中和,然后充分流水冲洗至少24小时。
    4)用化学方法测试不能确定脱钙的终点。
    2
    .硝酸水溶液:浓硝酸5-10ml,蒸馏水加至100ml。厚度5mm骨组织块脱钙12-24小时。
    优点:
    1)硝酸水溶液是一种迅速的脱钙液。
    2)对组织损害较少,细胞核着色比福尔马林-硝酸液要好。
    3)组织可直接通过70%乙醇去除酸。
    缺点:脱钙时间必需仔细控制防止过度脱钙损害组织。
    3
    .福尔马林-硝酸液:40%甲醛5ml,浓硝酸10ml,蒸馏水85ml5mm厚的骨组织块脱钙时间需要1-3天。
    优点:
    1)福尔马林-硝酸液是一种迅速的脱钙液。
    2)该液脱钙的组织比间苯三酚-硝酸液细胞核染色好。
    3)可作为紧急活检脱钙用。
    4)该液和5-10%硝酸水溶液一样对组织几乎没有损害。
    缺点:
    1)该液对细胞核作用较慢,使细胞核着色较差。
    2)要用5%硫酸钠液中和,然后充分流水冲洗至少12小时。
    4
    Perenyis 液:
    10%
    硝酸4份,0.5%铬酸3份,无水乙醇3份。
    5mm
    厚的骨组织块脱钙时间需要2-7天。
    优点:
    1)该液是一种温和的脱钙液,可能由于铬酸和乙醇的存在可以抑制组织泡软。
    2)细胞核和细胞浆细微结构着色均好。
    3)推荐该液作为常规脱钙使用。
    4)组织脱钙后不需要碱性液中和和流水冲洗。脱钙组织直接移到90%乙醇中。
    缺点:
    1)脱钙较慢,因此,紧急情况下不能使用。
    2)用化学方法测试不能确定脱钙的终点。
    5
    Von Ebeners液:
    饱和水溶液氯化钠 50ml,蒸馏水50 ml,浓盐酸 8 ml
    厚度5mm骨组织块脱钙3-7天。
    优点:
    1)细胞核染色相当好。
    2)不需要水洗,脱水时酸就会首先被脱出来。
    缺点:使用化学方法测试不能确定脱钙的终点。
    6
    .甲酸液:
    甲酸 10ml10%福尔马林盐 90ml
    厚度5mm骨组织块脱钙时间需要3-7天。
    优点:
    1)脱钙同时可以对组织固定。
    2)对细胞核染色比较好。
    3)推荐用于小块组织和牙齿脱钙。
    缺点:
    1)脱钙比较慢,不推荐作为常规标本脱钙使用。
    2)不推荐作为密皮质骨脱钙使用。
    3)要用5%硫酸钠液中和,然后充分流水冲洗至少18小时。
    7
    .三氯醋酸液:
    三氯醋酸5g10%福尔马林盐95ml
    厚度5mm骨组织块脱钙时间需要5-8天。
    优点:
    1)对细胞核染色好。
    2)脱钙之后不需要水洗,酸乙醇可以去除。
    缺点:
    1)脱钙作用慢,仅仅推荐用作骨的细针脱钙。
    2)不推荐作为密皮质骨脱钙使用。
    8
    Flemmings液:
    1%
    铬酸 15ml2%四氧化锇 4ml,冰醋酸 1ml
    Flemming
    s液虽然是一种固定液可作为微细骨针脱钙用。液体需要新鲜配制,并在容器底部会形成沉淀。脱钙后如果直接通过乙醇可以形成不能溶解的色素。脱钙之后标本必需充分流水冲洗去除过多的铬盐。使用化学方法测试不能确定脱钙的终点。用苏木精染色时细胞核受抑制。
    9
    AFIP甲酸-柠檬酸钠液:
    A
    液:甲酸25ml,蒸馏水25mlB液:枸橼酸钠(结晶)10g,蒸馏水50ml
    临用时A液和B液等量混合,每日换1次,因为柠檬酸钠可以和钙离子螯合,具有促进脱钙的作用。
    10
    .蒋维中(Jangweizhongs)液:
    盐酸80ml。甲酸70ml,三氯化钙50g,冰醋酸25ml甲醛100ml,生理盐水900ml
    此液脱钙迅速,0.5cm厚的松质骨6-20小时就可以完成脱钙。对组织影响极小,染色效果好。配制简便,脱钙后不需要用碱性液中和。
    (二)螯合脱钙剂脱钙法
    EDTA
    是一种良好的脱钙液螯合剂,它对组织破坏极小,不产生气泡,不影响染色,如果加温至37,可以加快脱钙速度。
    EDTA
    脱钙液:
    乙二胺四乙酸(EDTA5.5g10%中性福尔马林100ml
    厚度5mm骨组织块脱钙时间需要7-21天。
    优点:
    1)经EDTA脱钙的组织染色结果好。
    2)对组织的结构损害小。
    3)用化学方法测试可以确定脱钙的终点。
    缺点:
    1)脱钙速度相当慢,不适合常规标本脱钙使用。
    2)脱钙后组织会稍微变硬。
  • 快速石蜡切片
  • 一、电炉隔水加热法
    (1) 
    将薄小(10X10X2mm)的组织放入40%甲醛的小烧杯中,烧开10秒,然后移去酒精灯,再固定1分钟
    (2) 
    用手术刀将组织修成1毫米左右厚的薄片,再放回40%的甲醛(热)溶液内1分钟
    (3) 
    将组织取出,水洗
    (4) 
    用滤纸压干组织中的水份
    (5) 
    再放入水浴的纯丙酮中46分钟(中间更换一次丙酮)水温控制在70左右
    (6) 
    轻压组织有弹性感后,放入6070℃的石蜡中浸蜡5分钟
    (7) 
    用加热的电烙铁将组织嵌入事先准备好的空蜡块中,用载玻片压平组织,放在冰上冷却
    (8) 
    常规石蜡切片,轻轻的将蜡块修至组织面完全暴露后,切片,切片厚度45微米,修片时不能修的太厚,否则组织容易蹦出。
    (9) 
    将切片捞于载玻片后加热烤片1015秒,烤片温度不宜超过80,更不能将组织烤焦,可边烤边用湿布磨擦载玻片反面降温
    (10) 
    快速放入二甲苯快速脱蜡(2),梯度酒精洗,入水
    (11) 
    苏木素滴加在载玻片上,加热12分钟(60左右,不能将苏木素烧开,以防切片脱落)
    (12) 
    水洗
    (13) 
    盐酸酒精分化1秒钟
    (14) 
    水洗,温水蓝化
    (15) 
    伊红25秒钟
    (16) 
    梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
    注意事项:由于丙酮极易挥发燃烧,使用电炉隔水加热法必须时刻注意安全


    二、超声波快速处理仪法
    (1) 
    先将超声波快速处理仪开机预热至70
    (2) 
    将薄小(10X10X2mm)的组织放入40%的甲醛或AAF液的小烧杯中超声处理4分钟
    (3) 
    用手术刀将组织修成1毫米左右厚的薄片,再放回固定液内2分钟
    (4) 
    取出组织,水洗10秒钟,放在滤纸上吸干
    (5) 
    放入纯丙酮中超声处理23分钟,取出组织,放在滤纸上吸干,再放入纯丙酮46分钟,直至组织上浮
    (6) 
    放入二甲苯中超声处理3分钟
    (7) 
    放入熔融的石蜡中(70)超声处理5分钟,可用镊子轻压组织,直至无气泡产生
    (8) 
    用加热的电烙铁或镊子将组织嵌入事先准备好的空蜡块中,用载玻片压平组织,放在冰上冷却
    (9) 
    常规石蜡切片,轻轻的将蜡块修至组织面完全暴露后,切片,切片厚度45微米
    (10) 
    将切片捞于载玻片后加热烤片1015秒,烤片温度不宜超过80,更不能将组织烤焦,可边烤边用湿布磨擦载玻片反面降温
    (11) 
    快速放入二甲苯快速脱蜡(2),梯度酒精洗,入水
    (12) 
    苏木素滴加在载玻片上,加热12分钟(60左右,不能将苏木素烧开,以防切片脱落)
    (13) 
    水洗
    (14) 
    盐酸酒精分化1秒钟
    (15) 
    水洗,温水蓝化
    (17) 
    伊红25秒钟
    (18) 
    梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
  • 冷冻切片
  • 一、  恒温冷冻切片
     将组织在恒温冷冻切片机里切片。冷冻腔内的温度一般设置为-18-25℃,根据不同组织调节不同的腔温,平时应将冷冻头放置于冷冻台上。冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。
    (1)、 当冰冻组织取好后,有速冻开关的机器可先将开关打开,再在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替),放上组织,速冻。
    (2)、 待组织冻结后,将冷冻头装到切片机上
    (3)、 粗切,修出切面细切几张,用毛笔刷去刀上组织片
    (4)、 放下抗卷板,开始切片,切片厚度一般为56微米,切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇中固定,固定时间为1020
    (5)、 水洗
    (6)、 苏木素1分钟
    (7)、 水洗
    (8)、 盐酸酒精分化1秒钟
    (9)、 水洗
    (10)、温水蓝化
    (11)、伊红25秒钟
    (12)、梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

冰冻切片的注意事项:
(1)
速冻:是冰冻切片的关键,因为只有速冻才能减少组织内的冰晶,最好的办法是将速冻头迅速压在组织上,冻好后就可切片。特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织,最好放在液氮里处理。在液氮里冷冻要注意不要冻过头,23秒钟就要拿出来看一下,只要有4/5的组织已经冻住就可以了,待冷冻头拿出后刚好全部冻住,否则就会引起组织发脆,或冷冻头与组织分离。

(2)固定:切片后应立即放入甲醇中固定,不能等切片干后再固定,后者容易造成细胞退变。固定液有很多种,根据我们的实践,认为甲醇作用快,收缩小,染色较清晰,是冰冻切片最理想的固定液。如加5%冰醋酸较果更好。
(3)包埋剂:可用普通胶水代替,但要加入适量的水(胶水与水的比例大约在21左右)。太稀了,容易损伤切片刀;太稠了,粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。
(4)
冰冻用切片刀不仅要磨的快,而且要磨的直,否则切出的片子就不会平整,不能进入抗卷板。最好能使用一次性刀片。
(5)
如组织发脆,可等几分钟后再切,也可用手在组织上稍稍加温;如果用手去摸组织块,最好戴手套,或用玻片间的纸夹在手与组织之间,以防感染。
(6)
冷冻室的温度冬天一般设在-19℃左右,夏天设在-22℃左右。不同的组织,有不同的温度要求:肝脏、甲状腺组织温度控制在-15℃左右,脂肪组织一般在-35℃以下。

(7) 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态,经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤。

二、半导体制冷切片
(1) 组织放置在半导体制冷台上,加少量水,调好切片的厚度
(2) 接通循环流水后,再接通电源,在使用的全过程中不能中断流水,等电源关上后才能停水。并且正负极不能接反,用整流电源控制温度。冷冻组织周围的水不能过多
(3) 待组织发硬到可切成厚薄一致的切片时,即可切片。切片厚度56微米,切片用毛笔展平后,立即放入甲醇中固定,固定时间为1分钟
(4) 苏木素1分钟
(5) 水洗
(6) 盐酸酒精分化1秒钟
(7) 水洗
(8) 温水蓝化
(9) 伊红25秒钟
(10) 梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

三、二氧化碳冷冻切片 
a) 
先将组织放入加热的20%甲醛溶液中固定12分钟,水洗(也可将组织不经固定直接放在切片机的冷冻台上)
b) 
放在切片机的冷冻台上,加少量水,打开二氧化碳开关,此时有二氧化碳气体喷出,待组织出现冷霜后,关闭二氧化碳
c) 
切片,切片厚度68微米,将切出的片子放于水中舒展,用镊子将组织平铺于载玻片上(如未固定组织的切片直接用载玻片粘贴,立即放入甲醇中固定2秒,然后进行染色,)
d) 
加热烤片,烤片温度不宜超过60,更不能将组织烤焦。
e) 
染色时将苏木素滴加在载玻片上,加热1分钟(60左右,不能将苏木素烧开,以防切片脱落)
f) 
水洗
g) 
盐酸酒精分化1秒钟
h) 
水洗,温水蓝化
i) 
伊红25秒钟
j) 
梯度酒精快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

  • 睾丸活检病理阅片

·           睾丸活检是确诊无精子症后的一项必不可少的重要检查,通过睾丸活检检查可以把无精子症区分为梗阻性无精症、睾丸性性无精子症两类。睾丸性无精子症是由于各种原因所引起的睾丸生精功通低下所引起的睾丸本身即曲细精管的生精功通低下或缺如所引起,其进一步的检查及治疗需要依据睾丸生精功通的具体情况来确定下一步的诊疗措施,若是睾丸完全失去了生精功能,如唯支持细胞综征,曲细精管纤维化等,就失去了治疗的机会。就意味着此疾病治疗的结束。在此情况下就需要非常明确的告知患者就目前医疗条件下,即便是医学再发展亦不可能有从根本上治愈的机会,如想要孩子比较现实的做法只有两种选择:1、寻找一家有资质的被国家卫生主管部门批准的人类精子库进行非配偶间人工授精,亦即采用其他男性的精子进行人工受精,所得到的子女与本人没有血缘关系,因此在做此治疗前必需要有充分的心理准备,对此不能有任何的心理阴影。另一种就是抱养子女。但如果是由于生精功能低下,曲细精管内生精细胞数量减少或阻滞于某一阶段的话,就积极寻找引起生精功通低下所至的原发原因及依据睾丸生精功通损害的程度来评价是否进行进一步的检查及治疗及治疗的预后如何。

若通过睾丸活检检查睾丸曲细精管内各级生精细胞数量基本正常,并能见到成熟精子生成的话,最大可能性为梗阻性无精子症,但由于每一位医生的经历不同,知识结构不同,接诊患者例数不同,所从事的专业不同,对同一位患者的同一病理切片的阅读结果可能有非常大的差异与出入。这一评价结果却能影响到患者一生的命远。就经历了这样一位患者,在一家省级医院进行了一次睾丸活检检查,睾丸活检检查报告结果出得非常的不专业,对曲细精管的细胞学表现描述得很不到位,只简单的描述为睾丸生精功能低下。低下到何种程度,具体生精状况如何。使临床医生不所适从,最后我让他到这家医院的病理科把病理切片借阅出来后通过亲自观片,发现为较典型的梗阻性无精子症表现,曲细精管内可见到基本正常数量的成熟精子存在,只是由于病理科病理报告医生对这一特殊的病理标本阅读经验不足而出了以上的报告结果。并通过详细的病史询问及男性科检查,最后确诊为梗阻性无精子症。形成的具体原因为在其两岁的时候因双侧腹股沟疝进行了一次双侧腹股沟管疝手术。后通过输精管造影检查明确确寻找到输精管堵塞部位,并通过我们给予双侧输精管吻合术而恢复了输精管的通畅性。术后精液检查精液内有精子存在,半年后其妻喜得妊娠。为什么会对同一位患的同一病理切片的阅读结果会有如此大的差异呢?原因是在睾丸病理组织病理学上有其自身的特殊性,如:精母细胞体积相对较大,精子细胞体积相对较小,细胞核染色较深,成熟精子在睾丸组织病理切片中所看到的只是精子的头部,而没有尾部,而一般的病理医生大多认为成熟精子是正常形态是由头、体、尾所组成,但成熟精子的病理切片不可能象圆形细胞那样在组织病理切片中会观看到完整的组织细胞结构,而只能观看到精子的头部,因其体尾是病理组织学切片中是无法观察到的。只能在电镜中才可能观看到精子体尾的片段,一般光镜下是无法观察到的。而这一特殊的病理组织学特征大多数病理科大夫没有认知。

睾丸活检检查结果是确定无精症是否有必要进行进一步的检查及治疗与评价结果预后的一项重要检查。目前由于种种原因,有很多睾丸活检检查的报告不准确,临床医生不能正确阅读睾丸活检片子,造成对虽然做了睾丸活检,但是还不能真正了解睾丸的生精功能状况的情况。因此我们开设了这一睾丸活检病理会诊平台,以期能对无精子症患者的明确诊断提供我们有限的帮助。

睾丸活检是由医生从睾丸中取出少许睾丸组织,送往病理科做病理化验。目前做病理化验多是一些肿瘤性疾病,病理科的医生对肿瘤病理做的非常多,对于此方面的知识也非常的丰富。而无精子症的睾丸活检病理,在临床上都非常少,一般的病理科做睾丸病理远远少于肿瘤病理,对于此方面知识也了解甚少,同时又不能结合患者的双侧睾丸的大小,内分泌等情况做体分析。所以在发病理报告时不能够如实反应睾丸的生精功能。在我们这儿咨询睾丸活检结果时,看到的报告多是生精功能低下,或生精功能严重低下,生精细胞减少等不确定词语,无法从病理报告中确定睾丸的生精功能,这是病理科医生害怕出现误诊,不做出确切诊断,给自己留了余地。我们专业治疗无精子症,无精症来我科就诊者较多,十几年来我们做了数千例睾丸活检,对于每一例我们都亲自观看睾丸活检片子,在睾丸活检片子阅读方面总结了大量经验,具体的结果以我们观看睾丸活检片子为准,病理科的报告只供参考。根据显微镜下观看的睾丸活检片子结果,再结合一些特殊检查和男性科检查,对于每一例无精症来诊的患者都做出了一个非常明确的结论并作为下一步治疗的指导。   
   无精子症发症率低,大多临床医生对此经验不足,没有病理方面的专业知识,多不亲自观看睾丸活检片子,对于睾丸活检的结果完全以报告为准,又加上病理的报告的不准确性,所以有很多无精子症出现误诊的情况。我院自从专来开展无精症以来,有病理科固定人员制作睾丸病理片子和发病理报告,我们科里的医生对于每一例睾丸活检片子都亲自在显微镜下观看,并结合患者的睾丸体积和其它检查的结果做综合分析,目前没有一例误诊的情况。

为了减少对睾丸活检阅读的失误,我们现在开展了网上睾丸活检病理分析,你可以把睾丸活检片子邮寄过来,并把其它检查结果和一些重要的体征发过来,我们会给你综合分析并做出确切的诊断。具体病历可按照下面方法填写:

男方:年龄___结婚年限(或同居限)___男性科检查的情况(包括睾丸体积,附睾,输精管,精索情况)______手术史(如疝气,隐睾,精索,睾丸鞘膜积液等)_____腮腺炎史___,服用棉籽油史____检查精液的次数___,各自检查的结果____,是否做了内分泌检查,染色体检查,生化检查输精管造影检查,附睾穿刺等。详情请电话联系:13507692072  03708555222

 

文章录入:袁渭清    责任编辑:贾玉春 
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