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wHo推荐的精子表面抗精子抗体检测方法           ★★★

wHo推荐的精子表面抗精子抗体检测方法

作者:佚名 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2012/7/7 17:45:12

        精子上的IgG和IgA,可以用检测IgG和IgA的SpemMAR试剂直接在精液中分析。洗涤后,通过免
疫珠实验可检测精子上的IgG和IgA。 IgM型抗体非常罕见,在不育中只具有有限的重要性。他们的存在通过大量的精子凝集可降低精子的有效性。

        直接对抗精子表面的游离抗体实验,在不含精子的标本和血清或宫颈黏液中,为了检测直接对抗精子的游离抗体,不含抗体的供者精子被用来检测液体中任何游离抗体。然后,如以上所描述的直接实验那样,检测结合了这些供者精子的抗体。宫颈黏液可通过酶法(菠萝蛋白酶)或超声波降解法溶解。

         1.精子Spe肿MAR试验

        (1)直接SpermMAR IgG实验:该实验采用包被有人IgG的乳胶颗粒。正常情况下,精子与这些乳胶到精子没有吸附任何颗粒在游动,而颗粒(其表面上有抗体)将由于抗血清而聚集在一起;相反,如
果精子表面上有抗体,抗人免疫球蛋白将位于颗粒上的IgG与精子结合起来,随后,可以看到吸附着颗粒的活动精子在游动。在显微镜玻片上分别加上同等大小的液滴:一滴新鲜未洗涤的精液,一滴包被IgG.的乳胶颗粒,以及一滴针对人IgG的抗血清;用一个黄色吸管滴头首先将含有精液和包被IgG.颗粒的两个液滴混合;然后混合第3滴抗血清;在液体上放上盖玻片;3~10 min后在相差显微镜下(40x)分析,至少检查200个活动精子(尾部摆动的),观察是否携带颗粒。

        (2)直接SpermMAR IgA实验:SpermMAR IgA实验含有携带直接对抗人IgA的抗体(如抗人IgA)的
乳胶颗粒。因而,精子与这些抗IgA包被的颗粒混合后,如果精子表面有IgA,颗粒将与精子结合。    在显微镜玻片上分别加上同等大小的液滴:一滴新鲜未洗涤的精液,一滴包被抗IgA的乳胶颗粒;用
一个黄色吸管滴头混合,在液体上放上盖玻片;3~10 min后在40x相差显微镜下分析,至少检查200个活动精子(尾部摆动的),观察是否携带颗粒.

         (3)间接SpermMAR试验:间接SpermMAR试验是用于检测不含精子的液体中抗精子抗体(血清应
当被热灭活:在塑料管中56℃,45 min)。通过上游法或密度梯度离心法制备活动的供者精子;最终活动精子浓度调节到20x 106/ml;用于检测的标本被连续稀释,如稀释到1/16用于IgG实验和1/4用于IgA实验;用上游液稀释,如不含白蛋白和血清的Earle液(pH 7.4);将1 00μ1.精子悬液与1 00μ1已稀释的实验标本混合,37℃孵育60 min;加2 ml培养液,充分混匀,400 g离心10 min;去除上清,精子沉淀用50 μl培养液悬浮;按以上各自的SpermMAR,试验所描述的步骤1和2那样进行,但是用1滴制备好的精子悬液代替新鲜精液。至少计数200条活动精子(具有鞭打样尾巴)。结果以携带吸附颗粒的活动精子百分率来表示。如果50%或以上精子有乳胶颗粒吸附,则可能有免疫学问题。

         2.免疫珠实验结合到人精子表面的抗体可通过其他抗体(已被生产出来对抗人IgG、IgA和IgM免
疫球蛋白分子)来观察。免疫珠是吸附有抗人Ig抗体的塑胶颗粒。因而,抗IgG.、抗IgA和抗IgM免疫珠,别检测带有IgG、IgA和IgM型抗精子抗体的精子。

        (1)直接免疫珠实验

         ①对于每一种免疫珠类型,在相对应的圆锥形试管中,加0.2 ml贮存的免疫珠液到10 m1.缓冲液I中;②根据所用的精液量,移取所需的精液量到一个试管中,然后用缓冲液I加到10 ml。  ③所有试管室温下500 g离心6 min。  ④含有精子的试管:弃上清,将精子沉淀重新悬浮在10 ml新鲜的缓冲液I中,再同上离心;弃上清,将精子沉淀重新悬浮在200 μl.缓冲液I中。 ⑤含有免疫珠的试管:弃上清,将免疫珠重新悬浮在200 μ1.缓冲液Ⅱ中。 ⑥将5 Ixl每种类型的免疫珠液滴置于洁净的显微镜玻片上;加5 μl洗涤后的精子悬液于每滴珠中,用一个黄色吸管滴头充分混匀;在每个混合物上放一张盖玻片。 ⑦将玻片置于室温下一个潮湿的盘中10 min.,然后在20x相差物镜下分析c

        (2)间接免疫珠实验
         ①如以上步骤2至步骤4所描述的那样,在缓冲液I中洗涤正常供者精子2次,或最初通过上游法
或密度梯度离心法,然后洗涤;调节洗涤的精子悬液到最终活:动精子浓度在缓冲液Ⅱ中为50x 106m1。②用40 μl缓冲液Ⅱ稀释10 μl待测液体,然后与50 μ1.洗涤后的供者精子悬液混匀;37℃孵育60 min。 ③同上洗涤精子2次(步骤2至步骤4),然后同上述步骤6进行实验。 计算和结果:仅仅评价活动精子,计算具有2个或以上吸附的免疫珠(结合到尾部顶端的不考虑)的百分率。每个制备标本中至少计数复管中的200条活动精子。记录携带有免疫珠的精子百分率、免疫球蛋白类型(IgG或IgA)以及结合的位置(头、中段、尾部)。

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