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抗精子抗体的检查方法           ★★★

抗精子抗体的检查方法

作者:佚名 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2012/7/5 10:31:37
        测定抗精子抗体的方法,目前常用荧光抗体法、浅盘微量凝集法、伊红Y染色法、试管玻片凝集法、固相酶染色法、免疫洗选法(panning)、免疫珠法、ELISA法等。
        抗精子抗体在免疫性不育中的作用,已通过大量的实验研究和临床观察得到肯定。抗精子抗体无论存在于男方还是女方,都可导致不育。尽管抗精子抗体的作用机理及其对生殖的影响程度还不十分清楚,但抗体的检测对不育的治疗和预后的判断提供了有价值的指标。抗精子抗体的检出率因所采用的检测方法不同,各家报道的结果不一致。通常认为血清中的检出率在20%~30%。
    (一)试管玻片凝集试验
    1.检测对象凡检测抗精子抗体的夫妇,均应询问病史、年龄,了解婚后不育时间,有无习惯性流产或死胎病史,以排除器质性原因,如精索静脉曲张、前列腺炎、附睾炎、子宫颈炎、附件炎等。
    2.试剂  pH7.4、O.O1 mol/L的PBS:NaCl 8.5 g,KH2P04 O.2 g,Na2HP04·12H20 2.9 g,KCIO.2 g,加蒸馏水溶解后并补足至1000 m1.。    .
    3.操作  ①收集丈夫禁欲24 h以上的精液,自行液化,用PBS洗3次。通过4号注射器针头,使精
子分散。用PBS配成5~1 07/ml精子悬液。②夫妇双方血清56℃灭活后各取O.1 ml,加O.2 ml PBS,再加精子悬液O.1 ml(血清稀释度为1:4);阴性对照管取精子悬液O.1 ml,加PBS O.3 ml,37CC水浴l h.,轻轻混匀、滴片,加盖玻片镜检。
    4.结果  出现3条以上精子头对头,或尾对尾,或头尾结合即为凝集。观察1O个视野(400~),有5个
以上视野出现凝集即为阳性。
  ..  (二)免疫珠结合试验
  一其原理和方法同混合细胞凝集试验。采用包被羊抗人IgG.,IgA.,IgM的亲水性聚丙烯酰胺珠(免疫珠)来检测精子表面结合抗体,或待测血清(宫颈黏液)中的抗精子抗体。
    1.直接法(Jones法)测精子表面结合抗体
    (1)新鲜待测精液1滴,一式3份,分别加1滴最适稀释度的羊抗人IgG、IgA、IgM包被的免疫珠悬’
液,混匀后加盖玻片。
    (2)置湿盒1 h,然后在光学显微镜下观察。
    2.间接法检测精浆或血清、宫颈黏液中各Ig类别的抗精子抗体。操作方法同混合细胞凝集试验间接法。
    3.结果如果每高倍镜视野下可见免疫珠黏附2~3个以上能动的精子,试验为阳性。
    (三)固相酶染色法    ’
    1.试剂
    (1)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG F(ab’)2片段HRP羊抗人IgG F(ab’)2]:用方阵滴定法选择
最适浓度。
    (2)底物:溶液:3,3’二氨基联苯胺盐酸盐5 mg,先用O.1 m1二甲亚砜(分析纯,上海试剂二厂)助溶,再加O.O1 mol/L、pH7.4的PBS 5 ml,3%H202 0.05 ml,临用前配置。
    (3)糜蛋白酶:用等渗盐水配成2.5mg/mL,用于不液化的精液。
    2.操作
    (1)液化的新鲜精液离心后弃去上清,沉淀用PBS洗3次,配成5×107/ml精子悬液,过4号注射器针
头使精子分散。
    (2)夫妇双方成对检测,用丈夫精子悬液涂片一式2份,室温自然干燥,甲醇固定10 min.后再分别加
夫妇血清,37%湿盒30min,PBS洗3次,晾干。
    (3)加1:1 000稀释的HRP羊抗人IgG.F(ab’)2,37%湿盒30 min,PBS洗3次后加新鲜配制的底物
溶液,37℃湿盒反应15 min,洗3次,吹干。
    3.结果  :油镜下观察,精子呈棕黄色为阳性;精子不着色或极淡黄色为阴性。
    (四)酶联免疫吸附法(ELISA)
    1.试剂
    (1)人精子膜抗原:取20份正常生育男性的精液,液化后,用PBS洗5次,将沉淀的精子混悬于含0.5%NP-40 Tris-HCL缓冲液中,置4℃ l h,18 000 r/min离心30 min,上清液测定蛋白含量,即为精子膜抗原。    (2)O.01 mol/L、pH7.4的PBS。
    (3)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(HRP羊抗人IgG):自制或从生物制品单位购买,最适
浓度用方阵法滴定。
    (4)底物溶液:称取邻苯二胺(OPD)4 mg,加5.14 m1、0.2 mol/L的Na2HP04·12H20,再加O.1 mol/L枸
橼酸4.86 ml,加3%H202 50 μl。临用前配制。
  2.标本保存与处理
  (1)血清:静脉抽血约3 ml,分离血清,如当天无法检测,置于-20℃保存待检。检测时按1:6稀释(即
1 00 I~l标本稀释液加血清20 μl)。
    (2)精浆:待精液完全液化后,2 000 r/min离心10 min,取精浆置-20℃保存待检。检测时按1:1稀释
(即5’0 Ixl标本稀释液加精浆50μl)。如果精液不液化或黏稠度高时,可用双层滤纸过滤或加入1滴糜蛋
白酶(用生理盐水配制成2.5g/ml)。
    (3)宫颈黏液:无菌棉拭子蘸取宫颈黏液后加入O.5ml生理盐水,尽量将拭子上的宫颈黏液挤出,
置-20"(2保存待检。检测时按1:1稀释(同精浆)。 精浆和宫颈黏液中的AsAb主要为AsAb-IgG和AsAb-:[gA类型,建议同时检测这2种类型抗体。
    3.操作
    (1)将已包被的微孔板及所有检测试剂置于室温下平衡30 min,同时配制标本稀释液(含5%小牛血
清的PBS-T)。
    (2)根据不同待测标本,每孔加标本稀释液100 Ixl或50 μl,阴、阳性对照孔不加,空白对照孔加1 00 μl
标本稀释液。
    (3)依次加入标本(血清20 μl,精浆和宫颈黏液50 μl)和1 00μl阴、阳性对照。
    (4)42℃温育40 min。
    (5)用PBS-T洗板4次,每次3 min。
    (6)拍干后每孔加入2滴酶结合物。
    (7)42~C温育40 min。
    (8)同步骤5,洗涤、拍干后加显色液A、B各1滴。    .
    (9)混匀后避光反应10 min。
    (1 O)加终止液1滴,混匀后以空白孔调零,450 nm测吸光度值,P/N≥2.1为阳性。
    (五)免疫洗选法
    1.试剂
    (1)人IgG:用阴离子交换剂提取纯化,方阵滴定选择最适浓度。
    (2)羊抗人IgG:用人IgG免疫绵羊获得。
    (3)含5%小牛血清的PBS。
    2.操作取24孔聚苯乙烯反应板,用预先选定的最适浓度的人IgG(O.01 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲
液稀释)包被,每孔O.25 ml。4℃过夜后,用0.01 mol/1、pH7.4的PBS洗3次,再加入经预试验选择的羊抗人IgG工作浓度0.25ml,37℃水浴1 h,PBS洗3次备用。 液化新鲜精液(可用自身精液)离心弃上清液,沉淀的精子用PBS洗3次,再加含5%小牛血清-PBS校正精子数为5 x 106/ml。取精子悬液0.2 ml与O.2 ml待检血清在试管中混含,再加含5%小牛血清-PBS0.4 ml,37℃水浴l h,重复洗涤后恢复至原体积(O.8 m1)。取O.25 m1加到上述已包被的聚苯乙烯板孔中,37℃ 1 h,洗涤后用倒置显微镜观察结果。精子大量附着于孔底为阳性,孑L底无或仅有数个散在精子者为阴性。阴性对照孔加入未与待测血清作用的精子悬液。同时用试管一玻片凝集法、免疫洗选法、固相酶法检测生育夫妇、不育夫妇血清中的抗精子抗体,结果  ★与生育组比较,有极显著性差异(P<O.O1) 三种方法中试管一玻片凝集法有较高的检出率。可能是此法的结果同时反映血清中的凝集素与精子非特异性凝集,从而出现一些假阳性或反映血清中IgG和IgM两类抗精子抗体。而免疫洗选法和固相酶法则主要反映血清中IgG型抗体。试管玻片法操作简便,灵敏度高,阳性患者血清滴度高达1:64,免疫洗选法和固相酶法敏感性、特异性都较高,但操作较为繁琐。各实验室可根据自己的条件加以选择,如能同时采用两种以上的方法,可能会进一步提高抗精子抗体的检测水平。ELISA法对不育夫妇血清和精浆三种Ig类别抗精子抗体的检测结果表明,有的患者只有IgG类别.AsAb,有的可测出两种或三种Ig类别AsAb。同时检测三种Ig类别.AsAb较单纯检测IgG AsAb在不育、流产、无精子症三组中,可使血清.AsAb检出率提高8%~3 1%,可使精浆AsAb阳性率提高7%~1 8%。血清中.AsAb通常以IgG-AsAb、IgM-AsAb为主,精浆中通常以IgG-AsAb、IgA-AsAb为主。    37℃水浴l h后,光学显微镜观察 不育夫妇血清中三类AsAb的阳性率均显著高于生育组和婚检组;流产夫妇血清中Ig类别.AsAb阳性率均显著高于生育组和婚检组。

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