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精液的显微镜检查过程           ★★★

精液的显微镜检查过程

作者:佚名 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2012/6/27 17:21:51

        精液液化后,充分调匀,取一滴置于精子计数板上,在20x或40x物镜下用相差或光学显微镜进行检查。精液标本的检测应当在标本一停止流动就开始。如果漂移在60s内没有停止,湿片必须抛弃,重新制备一张新的。

       1.精子密度和精子总数好的质量必须有好的数量作基础,所以精子的密度和总数对生育同样很重
要。采用血球计数板、Makler精子计数板、Microcell计数池或Macro精子计数板,计数精子密度(即每毫升精液内的精子数目)。精子总数=精子密度×精液体积。

       2.活动力(率)  精子通过尾部鞭打样运动而呈现前向运动,是使其能通过子宫颈、子宫和输卵管而
与卵子结合的必不可少的条件,因此精子活动力是评价男性生育能力的最重要的指标。但精子的活动力又受很多因素的干扰,如精液的液化程度、离体时间、温度等。为客观反映精子的活动力,尽量在避免干扰因素的前提下,WHO推荐分级方法,有助于检验的客观性和准确性。 WHO建议将精子活动力分为4级:a.快速前向运动.b.慢或呆滞的前向运动;c.非前向运动;d.不动。

        操作方法:取液化均匀的精液一滴置载玻片上,盖上盖玻片,放置片刻,在高倍镜下观察5~10个视野,计数100个精子并进行分级,计算每类精子的数量,以百分率表示。为保证检查结果的准确,可同时再滴一玻片,重复检查一次,求出两次计数结果的平均值,两次之间的变异系数应该小于10%。WHO规定正常精子活动力:a级精子应不小于25%,或者a级和b级精子的总和应不小于50%。

        3.精子存活率精子存活率是采用染料对精子进行染色,根据精子是否着色判断精子的死活。一般精子死亡后,细胞膜的通透性改变,易于着色。这种检查也间接反映了精子质膜结构的完整性。精子活动率少于50%时,应进行精子存活率检测。操作方法:取液化均匀的精液_滴置载玻片上,加染色剂混匀,放置片刻,推成薄片,自然干燥后,在高倍镜下观察5~10个视野,计数100个精子中着色和不着色的精子数,不着色精子的比率即为精子的存活率。常用的精子存活率检测方法如下:
    (1)伊红Y染色法:一滴精液加等量的5g/L伊红Y(用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制)混匀后推成薄
片,自然干燥片刻,镜检。活精子不着色,.死精子着红色。
    (2)台盼蓝染色法:一滴精液加等量的20g/L台盼蓝(用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制)混匀后推成薄
片,自然干燥片刻,镜检。活精子不着色,死精子着蓝色。
    (3)苯胺黑伊红法:一滴精液加等量的5g/L伊红Y(用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制),再加2滴100g/L.
苯胺黑(用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制)混匀,1 min后推成薄片,自然干燥片刻,镜检。活精子不着色,死精子着红色。

        精子存活率和活动力的关系①正常精液精子存活率:射精后lh存活率大于60%、3h存活率大于50%、6 h存活率大于30%;②精子活动力:射精后l h无显著差异:6h活动力良好的精子占20%左右。若6 h活动力良好的精子降至5%以下,则可直接影响生育o

       4.非精子细胞  精液中非精子细胞是指精液中除精子外的细胞成分,主要为上皮细胞、生精细胞和白细胞。白细胞存在于大多数人的精液中,主要为中性粒细胞。白细胞精子症可以导致射精量、精子密度和精子活动力降低,同时可由于氧化应激或分泌的细胞毒性因子而影响精子的功能。正常精液中圆细胞数应不超过5x 106/ml,白细胞数不超过lx 106/ml

        5.精子的凝集精子凝集现象是指活动精子相互聚集,不活动精子相互粘连或活动精子与黏液丝或碎片粘连称为非特异性聚集而非凝集。凝集现象存在提示可能有免疫性不育或其他病因。凝集类型分为:头一头凝集,尾一尾凝集,头一尾凝集和中段一尾凝集。凝集检查的方法:取一滴液化的精液置载玻片上,盖上盖玻片,放置片刻,在高倍镜下观察10个视野,记录有无凝集和凝集的类型。

        6.精子形态学检查精子形态学的检查是评价精子质量的一个重要方面。正常精子的头部应呈椭圆形,长度应为4.O~5.5μm,宽2.5~3.5μm,长与宽的比值应为1.50-1.75。顶体区占头部的40%--70%,细胞质微滴不大于正常头部的1/3。操作方法:取液化的精液一滴涂片,在空气中自然干燥,放人95%乙醇和乙醚(1:1)的混合液中固定15--30 min,染色,用自来水冲去染料,将玻片吹干,在油镜下观察100个精子,计算正常精子与畸形精子的百  (2)苏木素-伊红染色法(HE染色法)
    ①染液的配制
    a.苏木素染液的配制:取苏木素1 g、乙醇10 m1.、钾明矾20 g、蒸馏水200 ml、氧化汞0.5 g,将苏木素溶
解在乙醇中;另将钾明矾加温溶于蒸馏水中。将两种溶液混合后煮沸,再将氧化汞缓缓加入,此时溶液呈
深紫色,立即将溶液冷却,隔日过滤。使用时每1 00 ml加冰醋酸4 ml,可增强染色力。
    b.O.5%伊红染液的配制:伊红1 g溶于5 ml蒸馏水中,滴冰醋酸于溶液中,有沉淀生成,至糊状再加
水数毫升,再滴人冰醋酸,直至沉淀不再生成,过滤后将沉淀干燥再溶于95%乙醇200 ml中即可。
    ②染色方法:取液化的精液涂片,空气干燥后,用甲醇固定至少5 min,干燥,将苏木素染液滴数滴于
玻片上,微火加温染色1 min,用水冲洗,再用伊红液复染数秒钟,水冲洗干燥后镜检。HE染色的结果:胞核
染成蓝色,胞浆被伊红染为淡红色,红蓝相映,便于观察检测。
    (3)巴氏(Papanicolaou)染色法
    ①染液的配制
    a.EA36储备液的配制:伊红Y 10 g溶于1 00 ml蒸馏水;俾斯麦棕色素Y I O g溶于100 ml蒸馏水;亮
绿SFl0 g溶于100 ml蒸馏水。
    EA36作用液:伊红Y 25 mL;俾斯麦棕色素Y 5 ml;亮绿SF 6.25 mL;加95%乙醇至1 000 m1.再加磷
钨酸2 g,饱和碳酸锂0.5 ml,充分混匀,置棕色瓶内,室温保存,用前过滤,溶液在2~3个月内可保持稳定。
  b.橙黄G6储备液的配制:
  橙黄G6,10 g溶于1 00 ml蒸馏水中,储于棕色瓶中备用。橙黄G6工作液:橙黄G6储备液50 mL,
95%乙醇加至1 000 ml,加磷钨酸0.15 g混匀,室温保存,用前过滤。 c.苏木素染液的配制:配制方法同前。
    d.Scott氏液的配制:取NaHC03 3.5 g、MgS04·7H20 20g,加蒸馏水1 000 ml即可。
    ②染色方法:取液化的精液涂片,空气干燥后,用95%乙醇与乙醚的混合液固定30 min,固定后涂片
再置80%、70%、50%乙醇中各1 0 s,水洗片刻,苏木素染3~5 min,.水冲洗3 min;Scott氏液中4 min;水洗
一次;置50%、70%、80%、95%乙醇各10 s;橙黄G6作用液中2 min;95%和1 00%乙醇各两次,每次10 s。
空气中干燥后镜检。
    ③染色结果:精子头部顶体区呈淡蓝色,顶体后区呈深蓝色,中段显淡红色,尾部显蓝色,细胞微滴通
常位于头的后部围绕中段呈绿色。
    巴氏染色是男性科学实验室应用最广泛的方法,它可使精子头部顶体、顶体后区、中段和尾部着色,
清楚区分嗜酸陛和嗜碱性细胞,并能详细观察核染色质形状。
    正常男性也有部分畸形精子,但畸形率应小于30%;若畸形率大于70%,则为畸形精子症。当异常精
子数量超过40%,会严重影响精子质量。精子的形态异常分类缺乏统一标准,目前使用的仍然是David
1 975年的分类,即精子头部畸形,包括长头型、纤细型、小头、大头、不规则、双头;中段畸形包括胞浆残余、
弯曲畸形;尾部畸形包括尾部阙如、短尾、卷尾和双尾。

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