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人体外周血细胞培养方法         

人体外周血细胞培养方法

作者:佚名 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2005/11/7 14:50:02

    【试剂】

    (1)细胞培养液:RPMI 164040ml,小牛血清10mlPHA(广州产)10mg,青、链霉素(100um1)O5ml。将以上成份无菌条件混匀,以lO%无菌NaHCO 3pH7274,分装培养小瓶,每瓶约5 m1,冰箱保存备用(可存放l周,不宜过久)

    (2)625um1肝素液:取12 500u肝素1支,加无菌注射等渗盐水18ml,无菌分装小瓶,冰箱保存备用(可用23)

    (3)10μgm1秋水仙素:取05mg秋水仙素加无菌等渗盐水50m1,分装小瓶,4保存。

    (4)0075toolL KCl溶液:称KCl(A·R)56g,加双蓉7K1 000m1

    (5)固定液:甲醇(A·R)3份,冰醋酸(A·R)l份。

    (6)Giemsa染色液:称取Giemsa染料5 g,甲醇(A·R)250m1,甘油(A·R)250ml

    Giemsa染料先用甲醇研磨溶解,加入甘油,放棕色试剂瓶中,半年后使用。

    【操作】

    (1)625umI肝素湿润空针,静脉采血1 m1,用6号针头滴加13滴,轻轻混匀,37培养箱培养72小时。

    (2)细胞的收集;

    ①培养68z卜时,每瓶加O1ml10ugml秋水仙素,使培养液的最终浓度为029gml

    ②培养72小时后取出培养物750×g离心10分钟。

    ⑨弃上清,用滴管轻轻混匀沉淀(05m1),于37水温箱内加入预热0075moiL KCl 8 m1,轻轻混匀,作用2分钟。

    ④立即加入新鲜配制的固定液l m1,混匀离心同上。弃上清,沉淀(05m1)加固定液6 m137作用30分钟。

    ⑤同上离心,再加固定液6 m1,吹打均匀,静止30分钟去上清,视细胞数量多少再加固定液,制成细胞悬液。

    ⑥制片:将上述细胞悬液12滴,滴到沾有冰水或干燥的洁净玻片上,速放7580烤箱2小时。取出GielTlsa染色(110GiemsapH74 PB配制),染色1630分钟,自来水冲洗,千后镜检。

    ⑦镜检30个细胞染色体数,3个核型分析有异常情况下,增加细胞核型计数、显微摄影、核型分析。

    【结果】

    (1)Klinefelters综合征(先天性曲细精管发育不全):由于染色体异常,伴有睾丸发育不良而导致男性不育。核型特征是47XXYXY的各种不同组合形式,或者是染色体的缺失和相嵌,主要是以多一个x染色体为其特征。临床表现睾丸小,无精子,乳腺常为女性化,血清LHFSI-{水平升高,睾酮水平在正常范围或偏低。睾丸组织学改变为曲细精管透明样变,间质细胞增生,无精子。 {生殖就医指南网 www.91zn.cn.是你知心的朋友}hCG刺激试验反应迟钝。

    (2)XYY综合征:染色体核型为47XYXYYY.在男性中约占02%,临床表现为正常男性,身材修长,可为无精子或少精,性激素水平基本正常,亦有升高者。  

    (3)单纯支持细胞综合征:睾丸小,缺少生精细胞,无精子,促性腺激素水平升高,而睾酮水平正常。

(4)性逆转综合征:本病的临床表现与Klinefelter综合征相似,外表为男性,但睾丸小,阴毛稀少或缺乏,染色体核型’为46XX,由于具有两个x染色体和一半Y染色体,可视为变异的K1inefelters综合征。

文章录入:男性病    责任编辑:男性病 
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